crisprcas9基因敲除技术流程(Cas9基因编辑技术大热)

CRISPR/Cas9 技术屡屡获奖,成为当前炙手可热的基因编辑工具。因其能介导高效率和高精度的基因组修饰,实现对肿瘤、遗传性疾病和感染性疾病等多种重大疾病的治疗,在生命科学领域大放异彩。然而缺乏合适的递送系统也限制了 CRISPR / Cas9 技术在临床上的应用,因此在这方面的研究也颇受关注。
 
络绎学术 Online 直播第 12 期,我们邀请到了浙江大学教授、博士生导师平渊教授为我们分享基因编辑非病毒载体在疾病治疗中的应用。
 
基因编辑技术
 
基因编辑技术 (genome editing) 可以精确地破坏、插入或替换基因组中特定位点的 DNA 序列, 在基因功能的研究和遗传疾病的治疗中发挥着巨大的作用。人工核酸内切酶 (engineered endonuclease, EEN) 介导的基因编辑技术极大地改善了早期基于同源重组的基因打靶技术 (gene targeting) 效率低的问题, 使得科研工作者可以高效地对各种细胞类型和生物的任何基因进行编辑。
 
目前,归巢核酸内切酶 (Meganuclease)、锌指核酸酶 (zinc finger nucleases, ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶 (transcription activator-like effector nucleases, TALEN)、成簇规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 及其相关蛋白这 4 类工具酶,在基因编辑技术中应用最多。
 
无论是 ZFN、TALEN 还是 CRISPR / Cas9,它们都是由 DNA 识别域与核酸内切酶两部分组成,在结构上具备相似性。其中 ZFN 技术具有锌指结构域能够识别靶点 DNA,而 TALEN 的 DNA 识别区域是典型串联 TALE 重复序列的中央结构域,DNA 剪切区域是一种名为 Fokl 的核酸内切酶结构域。CRISPR 的 DNA 识别区域就是 crRNA 或向导 RNA,Cas9 蛋白负责 DNA 的剪切。当 DNA 结合域识别靶点 DNA 序列后,核酸内切酶或 Cas9 蛋白将 DNA 剪切,靶 DNA 双链断裂,再启动 DNA 损伤修复机制,实现基因敲除、插入等。
 
在作用过程上,它们也具有相似性。通过 DNA 识别模块对特异性的 DNA 位点识别并结合,然后在相关核酸内切酶的作用下完成特定位点的剪切,从而借助于细胞内固有的 HDR 或 NHEJ 途径修复过程完成特定序列的插入、删除及基因融合。
 
通过和与其他技术的多方面对比,我们可以看到 CRISPR / Cas9 技术既有优势,也有限制。那么 CRISPR / Cas9 技术的前世今生又有什么样的故事呢?
 
基因编辑“魔剪”——CRISPR
 
1987 年,日本微生物学家石野良纯首次发现 CRISPR 。2012 年 Scribe Therapeutics 公司创始人之一 Jennifer Doudna 博士与 Emmanuelle Charpentier 博士利用 CRISPR 完成基因编辑。CRISPR 被认为是 21 世纪最重要的发现之一,于 2012 年、2013 年、2015 年 3 次入选 Science 评选的“世界十大科学突破”。
 
规律成簇的间隔短回文重复序列 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats sequences, CRISPR) 是能为细菌和古生菌提供对病毒和质粒的适应性免疫的 DNA 重复序列。CRISPR 基因序列主要由前导序列 (leader)、重复序列 (repeat) 和间隔序列 (spacer) 构成。2002 年,Jansen 实验室将临近 CRISPR locus 的基因命名为 cas (CRISPR-associated) ,并发现了 4 个 cas 基因 (cas1, cas2, cas3, cas4)。
 
CRISPR / Cas 系统是原核生物的一种天然免疫系统。某些细菌在遭到病毒入侵后,能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时,细菌能够根据存写的片段识别病毒,将病毒的 DNA 切断而使之失效。
 
CRISPR 系统有 Ⅰ 型、Ⅱ 型和 Ⅲ 型,其中 CRISPR / Cas9 作为 Ⅱ 型研究最多,是继锌指核酸内切酶 (zinc finger nuclease,ZFN) 、类转录激活因子效应物核酸酶 ( transcription activator-likeeffector nuclease,TALEN) 之外出现的第 3 代基因编辑技术,其介导的基因编辑可用于生成转基因模型、调节转录、调控表观遗传等。
 
CRISPR / Cas9 系统主要是由 Cas9 蛋白和单链向导 RNA (sgRNA) 组成,其中 Cas9 蛋白具有切割 DNA 双链功能,sgRNA 起导向作用。在原型间隔区相邻的基序 (protospacer adjacent motif, PAM) 存在的情况下,Cas9 蛋白能在 sgRNA 导向作用下通过碱基互补配对到达不同的靶部位,切割靶基因实现 DNA 双链断裂 (double strand break, DSB) 。
 
CRISPR/Cas9 技术工作中的 3 个关键因素
 
向导 RNA:定位目标基因的一部分 RNA。这是在实验室中设计的;
CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9):剪掉不需要的 DNA 片段的“剪刀”;
供体 DNA:原 DNA 链被剪断之后插入的所需的 DNA 片段。
 
DSB 修复主要有两种机制, 分别是非同源末端连接修复 NHEJ 和同源重组修复 HDR 。非同源末端连接 (non-homologous end joining, NHEJ) , NHEJ 介导的修复可在 DNA 双链断裂位点产生不精确的可变长度的插入和/或删除突变。其它的非同源重组修复途径也是存在的,比如微同源末端连接 (MMEJ, Microhomologymediatedend joining) 和单链退火途径 (SSA, Single-strand annealing)。
 
非同源修复的三种途径 NHEJ 、MMEJ 和 SSA 的区别较为明显。
 
/ NHEJ 途径修复 DSB 损伤是通过末端直接相连的方式进行的,这种连接不需要大片段的同源序列识别,而只需要 1-5 bp 的碱基配对就可以进行修复,属于一种易错修复。
 
/ 与 NHEJ 修复途径比较,MMEJ 修复与其最大的差别在于所识别的同源序列长度的不同。MMEJ 修复途径需要 5-25 个碱基同源序列,会常常造成连接处发生同源片段的缺失或者基因重排。这也属于易错修复。
 
/ 与 NHEJ 和 MMEJ 途径相比较,SSA 途径需要更长的同源序列 (>30bp) 来进行识别。SSA 途径可以导致基因组的缺失,这是其与 MMEJ 途径所类似之处。此外,SSA 与同源重组途径类似,也被归属为同源序列依赖型的 DSB 修复模式,两者都需要通过 5’到 3’的 DNA 剪切,产生 3’突出的单链 DNA。
 
同源重组修复 (homology-directed repair, HDR) ,HDR 介导的精确修复可以从单链或双链 DNA 供体模板引入精确的点突变或插入突变。“同源重组”机制在双链 DNA 修复中具有十分重要的细胞生物学意义。DNA 同源重组修复是一条涉及到多个步骤的复杂的信号通路,其中关键蛋白为 BRCA1 和 BRCA2。如果 BRCA 基因出现突变导致 BRCA1 和 BRCA2 蛋白失去功能,就会引起 HRD 功能异常 (Homologous Recombination Deficiency, HRD) 和PALB2, CDK12, RAD51, CHEK2, ATM 等相关基因突变、或 BRCA1 基因启动子发生甲基化导致基因组不稳定。当同源重组发生错误识别时,在非模板染色体执行“修复”可能会给细胞带来无法预估的伤害。比如,错误的识别来自另一个亲本的同源物,而不是姐妹染色单体作为模板来“修复”损伤的染色体。母本和父本染色体在许多位置上的 DNA 序列是不同的,因此,这种类型的修复可以将需要修复的 DNA 序列从母本转变为父本序列,或从父本转变为母本序列。
 
由于 CRISPR 具有简单、廉价和高效等优势,因此它已经成为全球最为流行的基因编辑技术,被称为编辑基因的“魔剪”。科学家通过它可以高效、精确地改变、编辑或替换植物、动物甚至是人类身上的基因,经过改造的 CRISPR 技术可被广泛地应用于生物医药和其他领域。
 
CRISPR 技术在许多领域的技术应用和联用都取得了重大反响,人们在安全性,道德和监管等方面对其关注度也日益上升。
 
CRISPR 技术应用前景广阔,在医疗、能源、农业、工业等领域有望大放异彩
 
开发新的诊断测试,靶向药物和治疗方法。通过将 CRISPR 与其他可切割目标 DNA 或 RNA 的 Cas 蛋白配对,然后切割其他分子以产生视觉信号,科学家可以确定何时存在病毒成分。科学家正在使用这项技术来开发诊断测试,以快速识别出诸如 COVID-19 之类的疾病。CRISPR / Cas9 正在测试用于某些疾病的可能治疗方法,包括镰状细胞性贫血和某些类型的癌症。CRISPR 也可用于通过改变昆虫或其他可传播疾病的生物的特性来帮助控制某些疾病。例如,科学家使用 CRISPR 使蚊子对引起疟疾的寄生虫更具抵抗力。
 
开发生物燃料。基因编辑可以提高藻类生物燃料的产量。利用 CRISPR / Cas9 技术,科学家能够找到并移除限制脂肪产生的基因。致力于研究商业化基因组学解决方案以解决全球能源与环境问题的美国生物技术公司 Synthetic Genomics 已经创造出了能产生两倍脂肪的藻类,然后用于生产生物柴油。迄今为止,藻类尚未产生足够高水平的脂肪以支撑生物柴油的大规模量产。通过 CRISPR / Cas9 技术,藻类将二氧化碳转化为生物燃料的效率有望大幅提高。Synthetic Genomics 目前正与石油公司埃克森美孚 (ExxonMobil) 合作。预计此次合作将实现到 2025 年,每天生产 10,000 桶(石油计量单位,每桶相当于 120 - 159 升)藻类生物燃料的目标。
 
更强壮,更抗病的农作物。CRISPR 可以通过增加营养成分,抗病性和在恶劣天气和土壤条件下的生存能力来改善农产品。在传统作物改良上,CRISPR 技术能带来产量、品质、抗病性和抗除草剂性等方面的提升。在农业育种和加速作物驯化方面,CRISPR 与其他技术的联用的创新层出不穷。目前,CRISPR 技术广泛应用于模式植物(拟南芥、烟草)和一些主要农作物,比如我们常见的水稻、小麦、玉米等。CRISPR 技术也促进了植物基因功能研究和预期农艺性状的选择。例如,当研究人员删除一小部分特定的黄瓜基因时,这些植物就不太容易受到已知会损害植物并造成严重农作物损失的病毒的侵害。CRISPR 基因编辑发明专家张锋教授、David Liu 先生和 Keith Joung 先生共同创立了一家名为 Pairwise 的新型农业公司。该公司致力于利用基因编辑技术,以新的方式利用农作物的自然多样性来应对全球粮食挑战。
 
更先进的工业产品。各个行业都在探索 CRISPR 潜在用途。除了开发新的生物燃料意外,可以解救环境灾难的细菌以及新材料也是工业产品与 CRISPR 技术联用的主要方向之一。专注于 CRISPR 的非治疗应用的创新技术公司 Caribou Bioscience 就提供了基于 CRISPR 的工具用以改善工业发酵过程,革新化学品和酶的生产过程。他们还用 CRISPR 操纵微生物,生产新的化学品。潜在的新型生物材料包括香精、香精和工业清洁产品。
 
CRISPR 基因编辑也引起了人们对其安全、道德和监管这三方面的关注
 
安全问题。使用 CRISPR 可能会带来意想不到的后果。例如,它可以靶向 DNA 内的“意外”位置,从而产生可能导致疾病或其他伤害的变化。尽管一些研究表明错误可能很少见,但仍然有待研究。此外,CRISPR 活性可能使细胞受压并阻止编辑。虽然某些细胞可以在 DNA 改变后恢复,但很多细胞是不能恢复的。
 
道德问题。伦理问题包括 CRISPR 是否将用于增强人类特征,例如增加的肌肉质量、学习能力和记忆力,以及是否可以公平地利用所有人群等。使用 CRISPR 编辑人类繁衍的影响也引发了伦理学问题。例如,遗传变化会在多大程度上影响子孙后代,是否应该允许对人类胚胎进行研究等。
 
监管挑战。许多国家在如何规范 CRISPR 和其他基因编辑技术的问题上难以决断。例如,在美国,目前尚不清楚基因编辑的作物是否将受到与常规转基因 (GM) 生物相同的法规的约束。虽然 FDA 在 2017 年就开始寻求有关其监管政策的公众意见,但是针对这一技术的行业新指南迟迟未发布。而在欧洲,2018 年的一项法院裁决确定,基因编辑作物将与转基因植物受同样的法规约束。有关基因编辑技术的监管仍然存在诸多问题有待解决。
 
病毒载体
 
病毒是一类能对人体细胞及其它动物细胞进行有效感染的微生物。病毒的本领是把自己的基因高效地导入到宿主细胞里去,具有良好的基因递送效能。因此,病毒被科学家们改造成为进行基因治疗的主要递送工具。在基因治疗中使用最广泛的病毒载体包括逆转录病毒 (retro virus, RV) 和慢病毒 (lentivirus, LV) 、腺病毒 (adeno virus, Adv) 以及腺相关病毒 (adeno associated virus, AAV) 等载体。
 
逆转录病毒载体属 RNA 病毒,但可在受染细胞内反转录产生 DNA 互补链,此 DNA 单链可作为模板合成第二条 DNA 链,第二条 DNA 链可掺入细胞基因组 DNA 中。此病毒可利用宿主细胞的酶自行转录与复制,RNA 可合成蛋白,再包装病毒,RNA 从胞内释放,成为感染性病毒,该载体可经不同方式改变。介导过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。
 
慢病毒属在分类上属于逆转录病毒科,包括 8 种能够感染人和脊椎动物的病毒,原发感染的细胞以淋巴和巨噬细胞为主,导致感染个体发病。慢病毒载体是一种单链 RNA 病毒,目前较为常用的病毒系统是四质粒系统。与其他逆转录病毒相比,慢病毒载体具备宿主更广泛、对于分裂和非分裂细胞均具有感染能力,稳定表达和经过构建后可携带大约 5kb 及更长的目的基因的特点。
 
腺病毒是无胞膜的线性双链DNA病毒,目前腺病毒科分为 5 个属。在临床和科研中,主要使用的是 Adv5 型腺病毒载体。腺病毒载体系统一般应用人类病毒作为载体,以人类细胞作为宿主,属于非整合型的病毒载体,因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。腺病毒载体还具备宿主范围广、对人致病性低、在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因、有效增殖滴度高、无插入致突变性、能在悬浮培养液中扩增、能同时表达多个基因的特点。
 
腺相关病毒是一类单链线状 DNA 缺陷型病毒,属微小病毒科。腺相关病毒基因组 DNA 小于 5kb,无包膜,外形为裸露的 20 面体颗粒。腺相关病毒载体具有安全性好,免疫原性低,能感染分裂细胞和非分裂细胞,能介导基因的长期稳定表达等优点。因此在神经系统的体内和体外研究中,腺相关病毒载体备受关注。
 
目前病毒载体仍然是临床试验的主流载体。病体载体的优点是转染效率高,但是缺点则包括特定人群无法使用、包装容量有限、免疫原性强和缺乏组织靶向性等。其中,慢病毒宿主范围广, 基因容量大,感染效率高, 能整合基因到宿主细胞,实现长期稳定表达,常构建稳定株;腺相关病毒免疫原性低,多种血清型,体内扩散能力强,常用用于体内研究;腺病毒携带外源基因片段大,感染效率高,主要用于体外难感染的细胞。
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    咽痒咳嗽的治疗 【证治方药】 ()风邪犯肺 治法:祛风利咽,宣肺止咳。 方剂:喉科六味汤(《喉科秘旨》)、三拗汤(《局方》)合桔梗汤(《伤寒论》)加减。 药物:麻黄3~...

    2022-04-03 来源:未知 浏览:377 次

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  • 装修工猝死变凶宅房主索赔25万 法院这样判的

    装修工猝死变凶宅房主索赔25万 法院这样判的

    根据田女士称,自己在2020年3月与北京某装修公司签订《装修施工合同协议书》,约定由装修公司为田女士房屋进行装修;但在装修期间有工人在晚上休息的时候,突发疾...

    2022-03-28 来源:未知 浏览:189 次

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  • 医保要交30年?年限不够怎么办可以一次性补交吗?

    医保要交30年?年限不够怎么办可以一次性补交吗?

    职工医保和养老保险有着同样的特点,只要累计缴纳一定年限,退休后即可享受终身医保待遇。医保要交30年吗?如果退休时年限不够怎么办?可以一次性补交吗?下面我...

    2022-04-04 来源:未知 浏览:199 次

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  • 钢琴搬运费一般要多少?

    钢琴搬运费一般要多少?

    一般钢琴搬运价格都是根据钢琴的型号来算的,拿我们常见的几种型号来说,型号为120(含)以下时,加费300元;型号为120以上时,加费350元;型号为125(含)以上时,加费380元...

    2023-05-04 来源:未知 浏览:92 次

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  • 喉咙有痰是什么原因造成的?不同情况化痰祛痰方法须知

    喉咙有痰是什么原因造成的?不同情况化痰祛痰方法须知

    感冒、咽喉炎等呼吸系统感染疾病通常伴随着喉咙里有痰的症状。有痰需要及时的咳出来,这样才有利于气体的交换。喉咙有痰时,大家可以在医生指导下使用一些化痰的...

    2022-03-28 来源:未知 浏览:132 次

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  • 深圳失业补助金多少钱一个月?

    深圳失业补助金多少钱一个月?

    我在深圳工作有很多年了,这几年因为疫情的关系我公司有不少员工被辞退了,担心自己以后会被辞退,所以现在想提前知道一下深圳失业补助金,那深圳失业补助金多少...

    2022-04-14 来源:未知 浏览:269 次

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  • 第三方检测机构排行,十大检测机构排行

    第三方检测机构排行,十大检测机构排行

    十大检测机构排行 1、中检CCIC 2、华测检测 3、SGS通标 4、Intertek 5、必维 6、百检网 7、谱尼测试PONY 8、DEKRA德凯 9、南德 10、广电计量 1、中检CCIC 中国检验认证集团是以检...

    2023-03-28 来源:未知 浏览:206 次

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  • 西游记十大恐怖之处 恐怖真相简直让人恐怖至极

    西游记十大恐怖之处 恐怖真相简直让人恐怖至极

    西游记十大恐怖之处:玉帝宝座,东海之底,狮驼国,山河社稷图,四探无底洞,北天门与东天门,兜率宫,酆都城,九幽之处,五行山底 西游记十大恐怖之处大猪蹄子...

    2022-05-04 来源:未知 浏览:639 次

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  • 试管婴儿大概需要多少钱

    试管婴儿大概需要多少钱

    试管婴儿的费用要根据实际情况来看,一般前期的检查加上治疗、用药,费用大概要3万元左右,并不是每一个周期3万元,而是根据患者的情况。如有一个患者,年轻女性...

    2022-04-10 来源:未知 浏览:146 次

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  • 成都到档查询入口汇总(电脑端+手机端)

    成都到档查询入口汇总(电脑端+手机端)

    成都到档查询攻略来啦,包括手机端及电脑所有的查询入口汇总,大家可以选择最方便的那个进行查询,还有常见问答汇总哦。 1、手机端 微信公众号查询 成都人社局微...

    2022-06-16 来源:未知 浏览:130 次

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  • 【怎样快速消除麦粒肿】解救方法治疗办法

    【怎样快速消除麦粒肿】解救方法治疗办法

    我们都了解麦粒肿是一直眼睛浮肿起来的含意,便是眼睑看上去非常糟,摸上去觉得皮肤最底层有一颗的米粒一样的物质,麦粒肿大部分是由于大家歇息不能。用眼过度造...

    2022-04-01 来源:未知 浏览:114 次

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  • 北京送外卖一个月能赚多少?北京送外卖真实工资

    北京送外卖一个月能赚多少?北京送外卖真实工资

    现在很多没有技术没有学历的人都会选择去做一份工作,那就是送外卖,这份工作没有什么过高的要求,门槛比较低,并且还是多劳多得,今天就带大家来看看北京送外卖...

    2022-07-03 来源:未知 浏览:3972 次

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  • 常见灭火器种类有哪些

    常见灭火器种类有哪些

    灭火器的种类有很多,不同类型的灭火器,对应的火灾类型也是不同的,所以必须提前了解。那么,常见灭火器种类有哪些?一起来看看吧。 一、常见灭火器种类有哪些...

    2023-06-21 来源:未知 浏览:192 次

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  • 利息税税率是多少(2022年利息税税率)

    利息税税率是多少(2022年利息税税率)

    什么是利息税? 是政府对你存入银行的资金获取的利息收入征收的税 (税率为利息所得的20%) 举个例子:你存入银行10000元,一段时间后你得到的利息比如说是1000元,那...

    2022-06-14 来源:未知 浏览:2575 次

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  • 咽干咽痒痒的一痒就想咳嗽

    咽干咽痒痒的一痒就想咳嗽

    咽喉疾病就会出现咽干,咽痒,咳嗽的症状,主要是考虑是细菌感染导致的,而且是比较严重的细菌感染的。一般的口服药物是不能治愈的,给以输液治疗,平时要多喝水...

    2022-04-03 来源:未知 浏览:115 次

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  • ppr内丝修复器27模头和28模头那个好些

    ppr内丝修复器27模头和28模头那个好些

    28模头更好。28模头的内丝修复器更容易把螺丝头的内部表面清理干净,而27模头的内丝修复器可能会留下一些杂质。...

    2023-02-09 来源:未知 浏览:134 次

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  • 专科生可以考公务员吗

    专科生可以考公务员吗

    专科生可以考公务员。专科生报考公务员和本科生一样,满足招聘公告里的年龄、户籍、学历、专业要求即可,根据这几年的公告,很多乡镇的机关单位,对于学历并没有...

    2022-12-06 来源:未知 浏览:142 次

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  • 考电工证要多少钱 报名费是多少?

    考电工证要多少钱 报名费是多少?

    是否报名参加考试取决于你自己的情况。大多数考生边工作边参加考试,所以报名参加一个班级仍然有优势,方便节省复习时间。如果考生有一定的基础,自制力强,也可...

    2023-02-17 来源:未知 浏览:73 次

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  • (免费)MBTI职业性格测试 在线测试mbti职业性格

    (免费)MBTI职业性格测试 在线测试mbti职业性格

    MBTI职业性格测试算是非常流行的一个职业测试了,目前大多数企业也会采用这个作为校招,社招的测评工具!知乎上对mtbi职业性格测试,很多停留在娱乐上了...还有很多...

    2022-10-03 来源:未知 浏览:370 次

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  • 海鲜生意的利润大概多少

    海鲜生意的利润大概多少

    海鲜是一种价格浮动很厉害的食品,某些由海鲜烹饪而成的菜式售价高达一万多元,例如一头鲍鱼和鱼翅等;但有些海鲜几十块钱就可以大快朵颐了,例如海鲜市场上卖的...

    2022-12-23 来源:未知 浏览:361 次

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  • pbam00是什么手机型号 pbam00是什么手机型号

    pbam00是什么手机型号 pbam00是什么手机型号

    Pbam00是OPPOa5全网通版的手机型号。是由OPPO公司研发的手机,于2018年3月发布。 1.外观 采用了纳米级微晶工艺,细腻又灵动。采用19:9超视野全面屏,屏幕尺寸高达6.2英寸,...

    2022-08-15 来源:未知 浏览:161 次

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  • 台湾发生79起地震 10吨重巨石掉落 目前是什么情况?

    台湾发生79起地震 10吨重巨石掉落 目前是什么情况?

    【台湾发生79起地震10吨重巨石掉落】中国地震台网正式测定:03月23日01时41分在台湾台东县海域(北纬23.45度,东经121.55度)发生6.6级地震,震源深度20千米。此后大小余震不...

    2022-03-23 来源:未知 浏览:197 次

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  • 沃尔沃XC60让6.8万 现车充足

    沃尔沃XC60让6.8万 现车充足

    近日,编辑从沃尔沃亚太了解到最新报价信息,近期到店订购沃尔沃XC60全系车型最高可享现金优惠6.8万元。感兴趣的朋友不妨点击报价表格中的获取底价,有机会享受更...

    2022-05-02 来源:未知 浏览:196 次

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